磁微粒化學發(fā)光免疫分析
化學發(fā)光技術是近二、三十年來發(fā)展起來的一種測定方式，其利用化學反應釋放的自由能激發(fā)中間體(常用堿性磷酸酶-金剛烷胺、辣根過氧化酶-魯米諾衍生物），使其從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)。當中間體從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時會釋放等能級的光子，對光子進行測定而進行定量分析?；瘜W發(fā)光具有熒光的特異性，同時不需要激發(fā)光，避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響有很高的靈敏度，并且避免了放射分析存在環(huán)境污染和健康危害，是一種非常優(yōu)秀的定量分析方法。
磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析簡介
免疫診斷的發(fā)展歷史[建議把免疫診斷發(fā)展史放在文章開頭，專題的邏輯可以如下：
免疫學發(fā)展史——化學發(fā)光技術——化學發(fā)光免疫分析——磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析]
免疫學的發(fā)展史起始于微生物學研究，于18世紀建立，19 世紀至 20 世紀中期進入經典發(fā)展期。這一時期，人們對免疫功能的認識由人體現(xiàn)象的觀察進入了科學實驗時期。20世紀初期到中期，進入近代免疫學時期。從20世紀中期開始，真正進入現(xiàn)代免疫學時期?，F(xiàn)代免疫學的檢測基本歷經了以下幾個過程，如圖1所示。
圖1.免疫檢測技術的發(fā)展史
免疫學檢測主要是利用抗原和抗體的特異性反應進行檢測，利用同位素、酶、化學發(fā)光物質等對檢測信號進行放大和顯示，常被用于檢測蛋白質、激素等微量物質。各類免疫學檢測方法的性質及發(fā)展狀況詳見表格1。免疫診斷在臨床診斷中占據著非常重要的地位，但是從我國臨床免疫診斷現(xiàn)狀來看，其步伐都落后于發(fā)達國家，亟待改進。
| 放射性免疫 | 酶聯(lián)免疫 | 化學發(fā)光 | 電化學發(fā)光 | 納米磁微?；瘜W發(fā)光 | |
| 檢測靈敏度 | 10-15 | 10-13 | 10-15- 10-18 | 10-17 | 10-21 |
| 精密度（批間差） | ＞15% | 10%-15% | ＜10%-15% | 5% | ＜10% |
| 線性范圍 | 105 | 102 | 106-7 | 107 | 107 |
| 檢測時間 | 3-4小時 | 2-3小時 | 65分鐘 | 10分鐘 | 18-40分鐘 |
| 放射污染 | 有 | 無 | 無 | 無 | 無 |
| 操作 | 手工 | 手工/批量自動化 | 手工/全自動 | 全自動 | 全自動 |
| 有效期 | 2個月 | 6-12個月 | 12個月 | 12個月 | 12個月 |
| 定性/定量 | 定量 | 定性/半定量 | 定量 | 定量 | 定量 |
| 發(fā)展趨勢 | 環(huán)境污染，國內處于衰退期；歐美已經完全淘汰。 | 國內處于成熟期；歐美處于衰退期。 | 國內處于導入期和成長期；歐美處于成熟期。 | 可使用項目廣泛，羅氏專利技術。 | 各項目可隨機組合使用，國內處于發(fā)展期。 |
表1. 各類免疫檢測技術的性質及優(yōu)缺點
化學發(fā)光技術是近二、三十年來發(fā)展起來的一種測定方式。該技術的原理是利用化學反應釋放的自由能激發(fā)中間體(常用堿性磷酸酶-金剛烷胺、辣根過氧化酶-魯米諾衍生物、辣根過氧化酶-魯米諾衍生物），使其從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)。當中間體從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時會釋放等能級的光子，對光子進行測定而進行定量分析（見圖2）?；瘜W發(fā)光具有熒光的特異性，同時不需要激發(fā)光，避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響從而提高了靈敏度，并且避免了放射分析造成的環(huán)境污染和健康危害，是一種非常優(yōu)秀的定量分析方法。
圖2. 化學發(fā)光基本原理示意圖
化學發(fā)光免疫分析（CLIA）是一種高度敏感的微量測定技術，凡具有抗原性的物質（包括半抗原）都可以用CLIA測定。CLIA起步于80年代初，快速發(fā)展于90年代具備以下特點 ：
①高度敏感，極限達10-17－10-19mol/L，遠高于放射性免疫（RIA）、酶聯(lián)免疫（EIA）。與時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)相當，但比TRFIA便宜。
②特異性強，重復性好CV＜10％。
③測定范圍寬，可達7個數(shù)量級。
④試劑穩(wěn)定性好，無污染有效期12月。
⑤操作簡單，易于自動化。
磁微粒化學發(fā)光免疫分析是將磁性分離技術、化學發(fā)光技術、免疫分析技術三者結合起來的一種新興分析方法，其基本原理見圖3 。該技術充分利用了磁性分離技術的快速易自動化性，化學發(fā)光技術的高靈敏度性，以及免疫分析的特異性，在生物分析領域展現(xiàn)了不可替代的作用。
圖3. 磁微粒化學發(fā)光免疫檢測（雙抗夾心法）原理示意圖
目前磁微粒化學分析免疫分析已經應用于管式化學發(fā)光免疫檢測項目以及電化學發(fā)光免疫檢測項目。
能夠用于化學發(fā)光免疫分析的磁珠種類
按材質分：
| 材質 | 優(yōu)點 | 缺點 |
| 磁性瓊脂糖微球 |
1. 親水性強，溫和的條件容易洗脫，不至于引起酶失活或蛋白質變性 2. 表面惰性，非特異性吸附低，受pH影響小 3. 容量大，具有開放性的支撐骨架 4. 組織相容性好 |
1. 機械性能和力學性能較差 2. 溶脹程度會隨溶劑性質變化 |
| 磁性二氧化硅微球 |
1. 機械強度相對較強 2. 化學穩(wěn)定性較優(yōu) |
1. 硅膠自身結構空隙較多，容易造成表面大量的水存積，增加了化學反應的復雜性 2. 堿性條件下非常不穩(wěn)定 3. 存在較大的非特異性吸附性 |
| 磁性聚丙烯酰胺/聚丙烯酸類高分子微球 |
1. 具有較好的親水性 2. 良好的血液相容性 3. 與其他高分子化合物共聚，改善其力學性能和穩(wěn)定性 | 收縮過大，易產生縮孔 |
| 磁性聚苯乙烯微球 |
1. 機械強度高 2. 表面易功能化 3. 表面非離子相互作用弱 4. 交聯(lián)聚苯乙烯能夠在強酸強堿中保持穩(wěn)定的結構 5. 微球粒徑大小可控 | 聚苯乙烯微球表面為疏水性，對某些蛋白存在非特異性，需要對表面進行功能化修飾 |
按照官能團分：
| 磁珠種類 | 常見活化方法 | 配體的反應位點 |
| 羥基磁珠 | CDI活化、溴化氰 | 氨基 |
| 羧基磁珠 | EDC活化，NHS活化 | 氨基 |
| 氨基磁珠 | 戊二醛活化 | 氨基 |
| 環(huán)氧基磁珠 | —— | 巰基、氨基 |
| NHS磁珠 | —— | 氨基 |
| SA磁珠 | 配體生物素標記 | 生物素 |
海貍磁珠應用于化學發(fā)光免疫檢測機理
| 免疫吸附種類 | 原理 | 舉例 |
| 磁性微球表面固定抗原 | 將抗原固定在微球表面，吸附相應的抗體和殘留有抗體活性的免疫復合物 | Mag COOH(70102) Mag NHS(70701) |
| 磁性微球表面固定抗體 | 將抗體固定在微球表面，吸附相應的抗原和殘留有抗原活性的免疫復合物 | Mag COOH(70102) Mag NHS(70701) |
| 磁性微球表面固定補體 | 利用補體Clq與免疫復合物的Fc段結合吸附免疫復合物，如DNA-抗DNA抗體復合物 | _ |
| 磁性微球表面固定蛋白A/G/L | 蛋白A/G/L固定在磁性微球表面，可吸附抗體和免疫復合物 | Mag protein A （22203） Magrsoe ProteinA/G（22202） |
| 疏水結合型 | 磁珠表面為疏水性材質，能夠與目標生物分子疏水作用力結合磁珠表面具有疏水性配體，能夠與目標生物分子共價作用力結合 | 對甲苯磺?；胖?疏水蛋白 聚苯乙烯微球+磷酯類蛋白 |
| 靜電結合型 | 配體與被吸附物靠靜電作用而結合。 | 磁性微球表面為帶陰離子基團的甲基白蛋白，可靜電結合帶陽離子基團的DNA-抗DNA抗體復合物 |
磁珠用于化學發(fā)光領域的方法
間接法
間接法就是包被抗原，然后用酶標記的抗抗體檢測樣本中抗體，基本原理見圖4，適合于檢測對象是自身抗體的情況。間接法的優(yōu)點：相對較方便，只要變換包被抗原就可以檢測不同的項目。間接法的缺點：標本中的特異性抗體會競爭性的結合抗原，使結果出現(xiàn)假陰性。
圖4. 采用間接法進行化學發(fā)光檢測基本原理
操作步驟：
a)磁性微球表面固定抗原。
b)加入樣本（含目標抗體）孵育，清洗。
c)加入酶標抗抗體孵育，清洗。
d)加發(fā)光底物，檢測信號。
捕獲法
血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定，因此測定IgM抗體多用捕獲法?；驹砣鐖D5所示，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，去除IgG后測定特異性IgM。
圖5. 采用捕獲法進行化學發(fā)光檢測基本原理
操作步驟：
a)將抗人IgM抗體連接在固相載體上形成固相抗人IgM，洗滌。
b)加入稀釋的血清標本中的IgM抗體被固相抗體捕獲洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。
c)加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合洗滌。
d)加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合洗滌。
e)加底物顯色，檢測信號。
固相抗原競爭法
競爭法，是指受檢抗體和酶標抗體競爭性的與磁珠表面抗原結合。固相抗原競爭法基本原理如圖6所示。結合于固相載體的酶標抗體與受檢抗體的量呈反比。若受檢樣本中無抗體，酶標抗體能夠順利與抗原結合，出現(xiàn)強信號。若受檢樣本中有抗體，則競爭性的占去了酶標抗體與抗原的結合，酶標抗體的結合力減弱，信號強度減弱。
圖6. 采用固相抗原競爭法進行化學發(fā)光檢測基本原理
操作步驟：
a)磁珠表面固定特異性抗原。
b)加受檢標本和酶標抗原的混合液孵育。
c)加發(fā)光底物，檢測信號。
雙抗夾心（兩步法）
雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，基本原理如圖7所示。
圖7. 采用雙抗夾心法（兩步法）進行化學發(fā)光檢測基本原理
操作步驟：
a)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜。
b)加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時問，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。
c)加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量成正相關。
d)加發(fā)光底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
雙抗夾心法（一步法）
在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hook effect），類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低于實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現(xiàn)假陰性結果（如圖8， 雙抗夾心法及雙位點一步法。缺點：假陰性）
圖8. 采用雙抗夾心法（一步法）進行化學發(fā)光檢測基本原理
圖9. 采用雙抗夾心法（一步法）進行化學發(fā)光檢測，當樣本中抗原量較多是，容易出現(xiàn)假陰性。
操作步驟：
a)磁珠表面固定一抗。
b)加樣本和酶標二抗孵育，清洗。
c)加發(fā)光底物，檢測信號。
海貍產品優(yōu)勢
領先的表面技術
蘇州海貍生物醫(yī)學工程有限公司，掌握先進的生物納米表面技術，能夠保證蛋白的覆蓋率、有效控制蛋白質的定向包被、充分表露蛋白的活性位點。生物納米表面技術成功將生物技術與納米技術融合，明顯改善一些生物材料表面的非特異性吸附現(xiàn)象。通過近4年的技術沉淀，已經申請相應專利12篇。
海貍公司生物納米表面技術，能夠保證蛋白的定向性，以及活性位點的充分暴露。
左圖普通技術包被的磁珠，表面抗體呈現(xiàn)雜亂無章，保持5%-10%的抗體活性。
右圖海貍公司采用定向包被技術，保證抗體的活性端充分暴露，保持抗體100%的活性。
自主研發(fā)磁珠
作為國內最大、種類最全的磁珠生產商之一，蘇州海貍生物醫(yī)學工程有限公司以國際領先的生物納米表面技術和高效生物試劑技術為核心，開發(fā)了一系列生物醫(yī)用磁珠及試劑盒。其中，磁珠類產品線囊括了多個領域，包括特異性標記與捕獲，蛋白快速分離與純化，核酸提取與文庫構建，及高通量、自動化生物樣本處理綜合技術平臺。目前，海貍公司已經發(fā)展成為一家集自主研發(fā)、規(guī)?；a和銷售服務于一體的生物醫(yī)學工程領域高科技企業(yè)。
海貍公司磁珠的微觀形貌
a）Mag COOH-2000掃描電鏡顯微鏡圖，該磁珠的粒徑分布均一，為2微米。表面光滑，能夠降低部分非特異性吸附。
b）Mag NH2-500偶聯(lián)SA蛋白后的掃描電鏡顯微鏡圖片。采用海貍納米科技表面技術包被的SA磁珠能夠保證SA蛋白的均勻包被，且避免磁珠的粘連。
c）磁性瓊脂糖微球的顯微鏡成像圖片。采用納米級磁核，填充于30-150μm的瓊脂糖微球內，形成載量極高的微球。對抗體的結合量達30mg/mL磁性微球。
d）將Magrose NHS磁珠偶聯(lián)熒光蛋白后，在熒光顯微鏡中成像圖片。該磁珠能夠促使蛋白均勻分布，且保證蛋白的利用效率。
定制服務
海貍公司憑借先進的技術優(yōu)勢和豐富的研發(fā)經驗，創(chuàng)建了高端研發(fā)技術服務平臺，可提供全面的生物研究試劑服務。
服務內容：
1.磁珠偶聯(lián)蛋白；
2.磁珠偶聯(lián)多肽；
3.磁珠偶聯(lián)抗體；
4.磁珠與核酸相關偶聯(lián)等技術。
服務特色：
1.技術領先，經驗豐富、富有開創(chuàng)性的專業(yè)研發(fā)團隊；
2.專業(yè)的項目管理人才，完善的項目管理系統(tǒng)；
3.量身打造的定制生產，幫助客戶降低資金和時間成本。
海貍磁珠（BeaverBeads?）在化學發(fā)光領域的應用
可用于化學發(fā)光領域的磁珠，種類如前面第三章所列。但其中，鏈霉親和素磁珠的使用最為廣泛，主要是因為親和素-生物素系統(tǒng)的通用型以及廣泛性。親和素-生物素系統(tǒng)（BAS）的主要特點如下列表。
| 靈敏度高 |
生物素容易與蛋白質和核酸類等生物大分子結合，并保持大分子物質的原有生物活性。 每個親和素分子有四個生物素結合部位，可同時以多價形式結合生物素化的大分子衍生物和標記物。 因此，BAS具有多級放大作用，使其在應用時可極大地提高檢測方法的靈敏度。 |
| 穩(wěn)定性好 |
生物素與親和素間的作用是目前已知強度最高的非共價作用，親和常數(shù)（K）為1015mol/L，比抗原與抗體間的親和力至少高1萬倍。 二者的結合穩(wěn)定性好專一性強，不受試劑濃度，pH環(huán)境，抑或蛋白變性劑等有機溶劑影響。 |
| 特異性強 | 親和素與生物素間的結合具有極高的親和力，其反應呈高度專一性。而且，BAS結合特性不會因反應試劑的高度稀釋而受影響，使其在實際應用中可最大限度地降低反應試劑的非特異作用。 |
| 普適性廣 | 生物素-結合素系統(tǒng)的多功能性還能提供一套統(tǒng)一的研究方法，適合用于不同的項目體系。 |
| 其他 |
通用性強，可制成多種通用性試劑（如生物素化二抗）適用于不同的反應體系。 生物素與親和素的結合具高速、高效的特性，盡管BAS的反應層次較多，但所需的溫育時間很短。 |
海貍鏈霉親和素磁珠，是采用蘇州海貍生物醫(yī)學工程納米表面技術，將重組鏈霉親和素蛋白高密度定向包被到超順磁性微球表面，排列均勻，并朝向一致。產品具有較高的生物素結合效率和較低的蛋白及DNA非特異吸附。每mg磁珠的游離生物素結合量高達800pmol以上，生物素化抗體結合量為20μg以上。
海貍鏈霉親和素磁珠化學發(fā)光實驗結果
在配合全自動化學發(fā)光儀進行檢測時，體現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性，以及與進口品牌磁珠相當?shù)撵`敏性。
| 化學發(fā)光免疫檢測**項目 | ||||||
| Competitor D | ||||||
| RLU-1 | RLU-2 | RLU-3 | AVE | CV | Ratio(S/0) | |
| S0 | 17026 | 17033 | 17804 | 17288 | 2.6% | / |
| S1 | 34203 | 33911 | 36506 | 34873 | 4.1% | 2.0 |
| S2 | 53255 | 53405 | 52721 | 53127 | 0.7% | 1.5 |
| S3 | 183657 | 187146 | 168984 | 179929 | 5.4% | 3.4 |
| S4 | 791664 | 827481 | 795708 | 804951 | 2.4% | 4.5 |
| S5 | 2058123 | 2204629 | 2248230 | 2170327 | 4.6% | 2.7 |
| S6 | 3777841 | 3635292 | 3651176 | 3688103 | 2.1% | 1.7 |
| BeaverBeadsTMStreptavidin | ||||||
| RLU-1 | RLU-2 | RLU-3 | AVE | CV | Ratio(S/0) | |
| S0 | 9591 | 9817 | 9777 | 9728 | 1.2% | / |
| S1 | 28132 | 29311 | 26109 | 27851 | 5.8% | 2.9 |
| S2 | 43037 | 42372 | 44145 | 43185 | 2.1% | 1.6 |
| S3 | 179352 | 165282 | 181423 | 175352 | 5.0% | 4.1 |
| S4 | 764793 | 731704 | 776344 | 757614 | 3.1% | 4.3 |
| S5 | 1967593 | 1950715 | 1960135 | 1959481 | 0.4% | 2.6 |
| S6 | 3365758 | 3348558 | 3605662 | 3439993 | 4.2% | 1.8 |
檢測方法：雙抗夾心兩步法
結論
BeaverBeadsTMStreptavidin具有很好的穩(wěn)定性能，CV值控制在5%以內與進口磁珠相當。
BeaverBeadsTMStreptavidin對非特異性具有良好的控制，S0明顯低于進口磁珠。
BeaverBeadsTMStreptavidin的靈敏度較高，Ratio（S/0）比值控制在2.0，與進口磁珠相當。
